Почему pH может стать причиной ложной реакции быстрого уреазного теста?

2

При правильной работе теста изменение его цвета происходит из-за продуктов первой реакции

помещение биоптата на тест

первая реакция:

уреаза H. pylori 

и мочевина

вторая реакция:

индикатор меняет цвет при повышенном pH

вторая реакция без первой  =  ложное срабатывание

тогда как при неправильной – индикаторная реакция вызвана посторонним повышением pH, не связанным с уреазной активностью H. pylori

 
 

История проблемы ложных срабатываний

В 1980-х с проблемой ложно-
положительных срабатываний 
столкнулся 
[1] Барри Маршалл
изобретатель быстрого

уреазного теста CLO-test:

«Когда у пациентов избыточное слюноотделение или рефлюкс щелочной желчи в желудок, эти жидкости способны контаминировать маленький образец желудочной биопсии, так что рН на его поверхности превышает 6.0» [2]

фото C.Northcott

с сайта nobelprize.org

3

Исследователи связывали нецелевое слабое окрашивание некоторых быстрых уреазных тестов с повышенным рН биоптата [3]

 

Ложные и целевые окрашивания быстрых уреазных тестов в клинической практике

ЛОЖНЫЕ окрашивания:

последующее гистологическое исследование подтвердило отрицательный Нр-статус биоптатов

1A-1_02A.jpg
2A-1_02A.jpg

ЦЕЛЕВЫЕ окрашивания:

последующее гистологическое исследование подтвердило положительный Нр-статус биоптатов 

4

* сфотографированные тесты не имеют отношение к продукции компании АМА

Ложные окрашивания сложно отличить от целевых [4]

по данным исследования, проведенного Старостиным Б. Д., заведующим Межрайонным гастроэнтерологическим центром №1 Центрального района Санкт-Петербурга, главным гастроэнтерологом Центрального района Санкт-Петербурга

 

Почему возможно ложное окрашивание теста?

1) Физиологические причины в самом биоптате:

     исследование слоя слизистого эпителия желудка in vitro показало среднее рН на уровне 6.9 [5] 
     измерения при помощи микроэлектродов показали,
что рН желудочного 

эпителия варьирует от 6.0 до 7.2 на фоне различных факторов [6] 
 
(индикатор бромтимоловый синий, использующийся в быстрых уреазных тестах, меняет цвет при рН выше 6.5)

5

2) Загрязнение биоптата посторонними щелочными агентами в результате

•     заброса желчи, рН которой может быть >7.0 [7]
     химических реакций, вызванных автолизом клеток 
ткани желудка [8]
     воздействия спрея лидокаина 
(содержит гидроксид натрия) [9] 
     попадания крови на биоптат при биопсии
(рН крови в норме >7,3) [10]

10-PH-er-3 500x500.png
 
Maastricht 38.jpg

Если на результаты влияет посторонний рН 
вместо уреазы Н. рylori, почему быстрые 
уреазные тесты рекомендованы Маастрихтом?

Потому что мировые производители быстрых уреазных тестов изменили их конструкцию (появились селективные уреазные тесты), что позволило принципиально исключить риск нецелевого смещения рН

Маастрихт V: «В клинической практике в случае наличия показаний к проведению ЭГДС и отсутствия противопоказаний к биопсии быстрый уреазный тест является диагностическим методом выбора

В случае положительного результата требуется незамедлительная 

терапия» [11]

6

Maastricht 38.jpg
 

Что такое селективные уреазные тесты

Селективные уреазные тесты гарантируют срабатывание только на продукты целевой ферментативной реакции, исключив влияние рН самого биоптата. В их конструкции слои ферментативной и индикаторной реакции разделены [12]

WiKipedia_2-01.png
КОНСТРУКЦИЯ AMA_RUT_PRO_BIOPTAT_01-1200-

II

I

I  чувствительный слой: реакция фермента 

уреазы H. pylori и мочевины, 
с образованием аммиака (первая реакция)

Кристаллы_4мал-02.png

только образовавшийся в ходе первой реакции аммиак проникает к следующему слою

II  слой индикаторной реакции: аммиак повышает рН (вторая реакция), что приводит к целевому изменению цвета

7

 

Селективные уреазные тесты: мировой опыт

Тест Pylo Plus, США:

«Биологический образец является источником веществ, которые могут приводить к ложноположительным результатам...

Улучшенная конструкция с физическим разделением субстратного слоя и индикаторного слоя исключает возможность ложных срабатываний» [13]

КАРТИКИ-ТЕСТОВ-Х_1.jpg

Тест Pronto-Dry, Франция:

«Элементы теста отделены друг от друга и не соприкасаются…
Отсутствие прямого контакта между исследуемым образцом и 
индикатором исключает ложно-положительные результаты»
[14]

КАРТИКИ-ТЕСТОВ-Х_2.jpg

Тест HelicotecUT Plus, Тайвань:

«Мембрана, размещаемая между первым и вторым слоями, блокирует гемоглобин и другие вещества, способные

просочиться и помешать тестированию, таким образом она обеспечивает точный результат реакции» [15]

КАРТИКИ-ТЕСТОВ-Х_3.jpg

8

Разделение слоев для исключения нецелевых 
срабатываний стало мировым стандартом

SL_1.png
3-1 СЛОЙ_КОНСТРУКЦИЯ теста AMA_RUT_PRO_О
SL_5b_A.png
SL_2b_A.png
SL_6.png

Селективный уреазный тест в России

чувствительный слой содержит субстрат для обнаружения 

ферментативной активности (мочевину, которую расщепляет 

уреаза Н. рylori с образованием аммиака) и представляет собой полупроницаемую гидрофобную мембрану 

Зарегистрированным в России селективным уреазным тестом является экспресс-тест
AMA RUT, РУ № РЗН 2019/9301
Как и должно быть у селективного уреазного теста, в AMA RUT Pro 
ферментативная и индикаторная реакции проходят в разных слоях.

слой индикаторной реакции: целевое изменение цвета происходит из-за повышения рН, вызванного прошедшим через мембрану аммиаком

Конструктивные решения медицинского изделия AMA RUT Pro защищены патентом в России [16] и проходят международное патентование [17]  

«AMA» и «AMA RUT» являются зарегистрированными товарными знаками ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики»

9

 
 
Фото 18.02.2020 СОДА КОРЕКЦИЯ_01_Х-1.jpg

Простой способ убедиться,

что селективный тест защищен

от срабатывания на pH биоптата

В отличие от индикаторной бумаги, селективный 
уреазный тест AMA RUT Pro выдерживает воздействие раствора соды (рН = 8.0)

 

Функциональные характеристики селективного уреазного теста AMA RUT Pro

Разделение реакций при помощи мембраны позволило достичь предела обнаружения 10  КОЕ H. pylori 

4

Отсутствие реакции на штаммы прочих уреазо-продуцентов желудка, на интерферирующие вещества (щелочные агенты, кровь) за счет конструкции теста

Диагностические характеристики:

Специфичность – 99%

Чувствительность – 99%

Полоса 99_99.jpg
АНИМЕ_NEW_2.gif
СБОРКА Реакций Теста АМА РУТ Про_20_ОКЕЙ

быстрый и наглядный результат

Hp или рН?

  • индикаторная бумага показывает рН

  • селективный уреазный тест – только                  H. pylori

Высокое качество + низкая цена = продукт мирового уровня

AMA RUT Pro

1_Great-BRITAIN.png
13_SPAIN.png
2_SWERIGE.png
3_POLAND.png
5_RUMANYA.png
6_CHILI.png
7_UKRAINA.png
8_ROSSIA.png
9_PORTUGAL.png
10_BRAZIL.png
11_EGIPT.png
12_PERU.png
 
 
 
 

Применение теста

Памятка для врача по использованию

1

Согните блок по линиям перфорации

2

Отделите один сегмент

для исследования

3

Откройте защитную плёнку,

но не тяните сильно, чтобы

её не оторвать.

Поместите биоптат на белый чувствительный элемент, 
а не за его пределы.

1_АМА-РУТ-Про PNG-01.png
2_АМА-РУТ-Про PNG-01.png
3_АМА-РУТ-Про PNG-01.png

4

Поместив биоптат, аккуратно пригладьте защитную плёнку пальцем по периметру изделия.

4_АМА-РУТ-Про PNG-01.png

5

Зафиксируйте плёнку по линии выреза. Фиксация необходима для сохранения продуктов реакции в ячейке экспресс-теста.

5_АМА-РУТ-Про PNG-01.png

6

Оцените результат исследования

с обратной стороны через 5 минут.

6_АМА-РУТ-Про PNG-01.png

Перед использованием ознакомьтесь пожалуйста с Инструкцией по применению, входящей в комплект поставки AMA RUT Pro.

 
ЛОГО_АМА-1_ЭКСпорт_ПНГ-01-49x49.png

Производство, сертифицированное по международной СМК

В ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики» с 2011 года первая в России интегрированная система менеджмента качества, соответствующая требованиям ГОСТ Р ИСО 9001 (ISO 9001) и ГОСТ Р ИСО 13485 (EN ISO13485).
 
Все производственные процессы валидированы

в соответствии с рекомендациями GHTF (Global Harmonization Task Force). Разработана и внедрена комплексная система внутреннего контроля основных и вспомогательных процессов производства тест-систем и оборудования.

DSC02424_1A SAYT.jpg
КАДРЫ_Сборки Теста Про коботом_4.jpg
 

Карта контактов

199034, Санкт-Петербург, 

17 линия В.О. д. 4 – 6 лит. Е пом. 1 Н

Тел.: 8 (812) 380 7699

Email:info@amamed.ru

Бесплатный федеральный номер

8 800 2222840

 

Список литературы

  1. Compositions and methods for the diagnosis of gastrointestinal disorders involving urease. United States Patent № 4,748,113. 1988. Barry J. Marshall. https://patentimages.storage.googleapis.com/a8/1e/14/7169715eac434e/US4748113.pdf

  2. Midolo P., Marshall B. J. Accurate Diagnosis of Helicobacter pylori: Urease Tests. Gastroenterology Clinics of North America. 2000. Vol. 29, №4, P. 871-878. doi.org/10.1016/S0889-8553(05)70154-0 https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0889855305701540

  3. van Keeken N., van Hattum E., de Boer W.A. Validation of a new, commercially available dry rapid urease test for the diagnosis of Helicobacter pylori infection in gastric biopsies. Neth J Med. 2006. Vol. 64, №9, Р. 329-333. https://pdfs.semanticscholar.org/02fd/f589158e657332c509a69e38c969ebc74083.pdf

  4. Старостин Б.Д. Сопоставление диагностических характеристик индикаторной бумаги и селективного уреазного теста для качественного определения Helicobacter pylori // Universum: Медицина и фармакология : электрон. научн. журн. 2020. № 2-3(66). URL: http://7universum.com/ru/med/archive/item/9010.

  5. Bahari H.M., Ross I.N., Turnberg L.A. Demonstration of a pH gradient across the mucus layer on the surface of human gastric mucosa in vitro. Gut. 1982. Vol. 23, №6, Р. 513–516. doi.org/10.1136/gut.23.6.513 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1419716/

  6. Cornelia Schade, Gunnar Flemström, Lena Holm. Hydrogen ion concentration in the mucus layer on top of acid-stimulated and -inhibited rat gastric mucosa. Gastroenterology. 1994. Vol. 107,  №1. P. 180-188. doi.org/10.1016/0016-5085(94)90075-2. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0016508594900752#ceab10

  7. Champion G. et al. Duodenogastroesophageal reflux: Relationship to pH and importance in Barrett's esophagus. Gastroenterology. 1994. Vol. 107, №3. P. 747 – 754. doi.org/10.1016/0016-5085(94)90123-6 https://www.gastrojournal.org/article/0016-5085(94)90123-6/pdf

  8. Ulf Westblom. T et al. Evaluation of a rapid urease test to detect Campylobacter pylori infection / Journal of clinical microbiology. 1988. Vol. 26, №7, P. 1393-1394. https://jcm.asm.org/content/jcm/26/7/1393.full.pdf

  9. Продуктовая линейка - Лидокаин / Официальный сайт АО Фармстандарт / [Электронный ресурс]. - Режим доступа: URL  https://pharmstd.ru/index.php?page=129&lid=153 

  10. Hopkins E. Sharma S. Physiology, acid base balance. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing, 2019. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507807/

  11. Раздел Selective urease test страницы Rapid urease test / Wikipedia The Free Encyclopedia/ [Электронный ресурс]. – Режим доступа: URL https://en.wikipedia.org/wiki/Rapid_urease_test

  12. P. Malfertheiner et al. Management of Helicobacter pylori infection—the Maastricht V/Florence Consensus Report. Gut. 2017; Vol.66. P.6–30. https://gut.bmj.com/content/66/1/6

  13. Test Strip for H. pylori detection. WO2012054545A1;US2012094371A1. 2012. Behar Morris. https://worldwide.espacenet.com/patent/search/family/045934470/publication/WO2012054545A1?q=WO%202012054545

  14. Urease test for detecting Helicobacter pylori bacteria. World International Property Organization International Publication Number WO 2011/112106 A2. 2011. Stanisław Kafel. https://worldwide.espacenet.com/patent/search/family/044501614/publication/PL390673A1?q=390673

  15. Detection test piece and detection method thereof for stomach Helicobacter pylori. CN101748185A.2010. Jiazhen Liu. https://worldwide.espacenet.com/patent/search/family/041608754/publication/CN101748185A?q=pn=CN101748185A

  16. RU2715405C1 - Тест-система для определения ферментативной активности бактерий по аммиаку - Google Patent / patents.google /   [Электронный ресурс]. – Режим доступа: URL https://patents.google.com/patent/RU2715405C1/ru

  17. WO2020139142 TESTING SYSTEM FOR DETERMINING THE ENZYMATIC ACTIVITY OF BACTERIA ON AMMONIA / Patentscope /  [Электронный ресурс]. – Режим доступа: URL https://patentscope.wipo.int/search/zh/detail.jsf?docId=WO2020139142&tab=PCTBIBLIO&_cid=P12-KC5ZD1-18733-1

  18. Gothia Medical - AMA RUT PRO - Hp-test med svar inom 5 min / Gothiamedical /  [Электронный ресурс]. – Режим доступа: URL https://www.gothiamedical.se/sv/info/produkter/endoskopi/hptest/amarut/

  19. AMA RUT PRO - medipment.pl / Medipment /  [Электронный ресурс]. – Режим доступа: URL https://www.medipment.pl/produkt/rut-pro-100122

  20. AMA-Med OY Visual evaluation express-test for the Detection of Helicobacter pylori Urease Activity in Biopsy Specimen / Mednet /   [Электронный ресурс]. – Режим доступа: URL http://www.mednet.lv/en/product/2378-110/visual-evaluation-express-test-for-the-detection-of-helicobacter-pylori-urease-activity-in-biopsy-specimen-ama-med-oy/

  21. Test rapid la ureaza pentru depistarea Helicobacter pylori AMA RUT PRO / licitatie-publica /  [Электронный ресурс]. – Режим доступа: URL https://www.licitatie-publica.ro/licitatii/test-rapid-la-ureaza-pentru-depistarea-helicobacter-pylori-ama-rut-pro--1-card-x-24-teste?searchProfileId=&user=&token=&uuid=031c0026-d50b-4fef-bf4f-4f63d8008732

  22. Kit Test Ureasa HPylori / Vytrous / [Электронный ресурс]. – Режим доступа: URL https://www.vytrous.com/product-page/kit-test-ureasa-hpylori